TÁCH CHIẾT ARN TỪ MÁU NGOẠI VI/ TỦY XƯƠNG (RNA ISOLATION)

Tách Chiết ARN từ Máu Ngoại Vi và Tủy Xương

Nguyên lý

ARN thông tin, chứa mã hóa cho các axit amin, nằm trong tế bào chất. Để tách ARN, thường sử dụng chất tẩy mạnh để phá vỡ màng tế bào, kết hợp với các chất biến tính protein nhằm loại bỏ protein, và cuối cùng sử dụng cồn 96º ở nhiệt độ thấp để thu được ARN tinh khiết và nguyên vẹn.

Chỉ định

Kỹ thuật này được sử dụng cho tất cả bệnh nhân có chỉ định làm xét nghiệm RT-PCR/qRTPCR.

Chống chỉ định

Không có chống chỉ định.

Chuẩn bị

Người thực hiện

• Kỹ thuật viên xét nghiệm sinh học phân tử đã qua đào tạo;
• Tất cả mẫu bệnh phẩm có chỉ định xét nghiệm RT-PCR hoặc qRTPCR.

Phương tiện - Hóa chất

Phương tiện

1. Tủ hút hóa chất (chemical fume hood);
2. Buồng vô trùng (biological cabinet);
3. Máy ly tâm tốc độ cao (tối đa 14.000 vòng/phút);
4. Máy vortex;
5. Pipet các thể tích 10 µl, 20 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl;
6. Đầu côn có màng lọc;
7. Ống Eppendorf 1,5 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
8. Ống PCR 0,2 ml vô trùng, không có enzym nucleaza;
9. Tủ lạnh 4-8°C, tủ âm sâu -20°C;
10. Găng tay.

Hóa chất

Sử dụng kit tách ARN thương mại hoặc nếu tách thủ công thì cần các sinh phẩm như glycogen, proteinase K, đệm ly giải tế bào, phenol/chloroform, cồn tuyệt đối.

Các bước tiến hành

Lấy bệnh phẩm

• 2 ml máu ngoại vi hoặc dịch tủy xương chống đông bằng EDTA.

Tiến hành kỹ thuật

Quy trình tách chiết ARN bao gồm các giai đoạn chính sau:

1. Loại bỏ tế bào hồng cầu:

   ARN chủ yếu nằm trong tế bào có nhân, do đó cần loại bỏ tế bào hồng cầu. Có thể sử dụng dung dịch Ficoll (tỷ trọng 1.077) để phân lớp hoặc dung dịch ly giải hồng cầu (như 1M MgCl2, 5M NaCl, 1M Tris-HCl). Sau khi loại bỏ tế bào hồng cầu, dung dịch còn lại chứa tế bào có nhân sẽ được sử dụng để tách ARN.

2. Phá màng tế bào và màng nhân:

   Tế bào có nhân được ủ trong dung dịch chứa chất tẩy mạnh (như SDS, sarcosyl) và một chất biến tính protein (như guanidinium thiocyanat), kèm theo chất khử (2-mercaptoethanol) để phá vỡ màng tế bào và ngăn chặn hoạt động của enzym phân hủy ARN (ARNaza).

3. Loại bỏ protein:

   Dung dịch phenol/chloroform được sử dụng để biến tính protein, tạo ra lớp tủa sau khi ly tâm, dễ dàng loại bỏ khỏi hỗn dịch.

4. Kết tủa ARN:

   Sử dụng cồn tuyệt đối để tủa ARN trong điều kiện đông lạnh, sau đó thu hồi ARN bằng ly tâm. ARN cần được hòa tan trong nước khử enzym nucleaza.

Nhận định kết quả

Sử dụng 5 µl ARN thu được để điện di trên gel agarose 0,5 - 0,8%, đồng thời kiểm tra độ sạch bằng đo quang phổ (A260/A280). Chất lượng ARN tốt nếu có ba băng điện di tương ứng với ARN 28S, 18S và 5,8S; tinh sạch nếu A260/A280 trong khoảng 1,8 – 2,0.

Những sai sót và xử trí

Sai sót

• Lấy mẫu không đủ hoặc sai chất chống đông.
• Thao tác pipet không chính xác.
• Tín hiệu phản ứng không rõ ràng.

Xử trí

• Thực hiện theo đúng hướng dẫn lấy mẫu.
• Sử dụng pipet theo đúng thể tích quy định.
• Bảo quản hóa chất đúng theo khuyến cáo của nhà sản xuất và thực hiện đầy đủ các bước trong quy trình xét nghiệm.

Thiết Bị Tâm Phát sẽ hỗ trợ tối ưu trong từng bước tách chiết ARN, đảm bảo quy trình diễn ra suôn sẻ và hiệu quả.